克隆技术(DNA连署)

利用DNA 连署酶把载体 DNA 和要克隆的目标 DNA 断片连署在一块儿，变成一个完整的重组分子，这就是分子克隆中等说的连署反响。当载体 DNA 和外源 DNA 末端都是由一种萌生粘性末端的内切酶割切萌生的话(同尾酶也可以)，还是两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那末经退火后可形成新的重组分子。连署后萌生的重组分子中还是保存着外源 DNA 两端的限止性内切酶切点 ，因此使我们能便捷地从重组分子再次抽取所克隆的DNa段。

试药与器具材料

l ．试药

(l )T4 DNA 连署酶稀释液： 50mmol / L Tris-Cl ，pH7.5 ，500μg/ml BSA (牛血清白蛋白)。

(2 )外源 DNA(P-DNA): AcNPV 变株 m29DNA 的 BamHI 割切萌生的 F 断片，分子量约 1.9 kb ，液体浓度 1μl=5ng 。

(3 )10 ×连署反响液： 700 mmol / L Tris-HCl ，pH7.5 ，70mmol / L MgCl2 ，0.7mmol / L ATP 。

(4 )载体 DNA(V-DNA): M12 mp19RF DNA ，经 BamHI 割切 ,分子量约 7.2kb ，液体浓度约 lμl ＝10 ng 。

2.器具材料； 恒温水浴器、真空干燥箱、电热恒温鼓风干燥箱、生化培养箱、离心机等。

[操作]

(1 )取 3 支 eppendorf 离心管，标上 1 、2 、3 号。

(2 )顺次加水、V-DNA ，在 2 ，3 号管加 P-DNA 。

(3 )离心 3 秒，置 65 ℃干燥箱 10 分钟，而后抽取插进去冰中。

(4 )用 T4 DNA 连署酶稀释液把 T4 DNA 连署酶稀释至 0.2 U / ml 。

(5 )按表中所示的量参加 10 ×缓和冲突液，在 1 及 3 中加连署酶。

(6 )混匀，离心3 秒钟，置 12 ℃恒温水浴过夜。第二天抽取，如不做转染放 -20 ℃保留。2 和 1 为对照，以查缉 V-DNA 的酶切效果和连署酶连署效果。

如今宝灵曼企业已推出迅速连结 DNA 试药盒。该试药盒能在室温下 5 分钟内将粘性末端或男子发式末端断片连署。施行反响需求的全部试药已涵盖在试药盒内。